背景
对小鼠和人类的研究表明，肠道微生物群可以调节肿瘤对化疗或免疫治疗的反应。研究发现与未治疗组相比，接受抗生素治疗的癌症患者对抗PD-1免疫治疗的反应较低，而用抗PD-1应答患者的粪便重建无菌小鼠，改善了肿瘤控制和T细胞应答。肠道微生物群合成了许多特定的代谢物，一些微生物代谢物可以影响癌症的发展和系统免疫反应。然而肠道菌群如何调节远端抗肿瘤免疫以及肠道菌群是否能调节肿瘤浸润性CD8+T细胞应答尚不完全清楚。在本研究中，研究人员发现肠道微生物代谢产物，特别是丁酸盐可以通过调节肿瘤微环境（tumormicroenvironment，TME）中的CD8+T细胞功能来促进oxaliplatin的疗效。其作用可能通过促进IL-12信号通路，在体外和体内以ID2依赖的方式直接提高了抗肿瘤细胞毒性CD8+T细胞的反应。
结论
1.肠道微生物代谢物通过CD8+T细胞依赖性的抗肿瘤免疫反应促进化疗疗效
为了检测肠道微生物是否通过其代谢物具有抗癌作用，研究人员采集野生型（WT）小鼠的肠道内容物上清液，将制备的水溶性的肠道提取物预先灌胃给联合抗生素处理的小鼠（ABX），14天后，Mc38结肠癌细胞皮下接种小鼠，接种7天后采用化疗药物oxaliplatin治疗（图1A）。与先前的报道一致，oxaliplatin控制Mc38的生长，但ABX治疗显著降低了疗效。然而ABX处理的小鼠在重新补充肠道微生物代谢物后显示出显著的化疗后肿瘤消退。提示肠道菌群可能通过其代谢物影响癌症治疗反应。
像oxaliplatin这样的抗癌治疗可能会诱导免疫原性癌细胞死亡，并引发肿瘤破坏性免疫反应，且CD8+T细胞抗肿瘤免疫中发挥重要作用,研究人员检测了CD8+T细胞,发现oxaliplatin治疗导致CD8+T细胞在肿瘤微环境中的积累并且增强由在dLN中的CD8+T细胞产生的IFN-γ,经过ABX处理后CD8+T细胞及IFN-γ产生几乎完全抑制。肠道微生物代谢物足以增加ABX处理的小鼠CD8+T细胞的肿瘤浸润和促进IFN-γ的产生（图1C、D）。提示肠道微生物代谢物可能通过促进CD8+T细胞反应来促进化疗疗效。
接下来，研究人员测试了CD8+或CD4+T细胞是否是微生物代谢物诱导的肿瘤消退所必需的。结果显示CD8+T细胞的消耗，而不是CD4+T细胞，完全消除了肠道微生物代谢物的抗肿瘤作用（图1E）。说明CD8+T细胞在微生物代谢物抑制肿瘤中发挥了重要作用。
由于CD8+T细胞是补充代谢物后唯一显著恢复的细胞群（补充实验数据显示CD4+T细胞、DCs、Treg、MDSC在检测的组织中没有差异），研究人员假设微生物代谢物可能直接调节CD8+T细胞。将CD8+T细胞分离后，用不同剂量的代谢物处理。能观察到代谢物处理后IFN-γ的产生增加，且呈剂量依赖性（图1F）,说明肠道微生物代谢物处理确实可以通过直接调控CD8+T细胞来诱导IFN-γ的产生。
以上数据表明，肠道微生物代谢物可以调节CD8+T细胞的抗肿瘤反应，促进化疗的疗效。
Fig1肠道微生物代谢物通过抗肿瘤CD8+T细胞反应促进化疗疗效（A)实验设计:用抗生素加水溶性肠道微生物代谢物(WSMMs)处理小鼠，接种Mc38细胞，奥沙利铂治疗。(B)监测肿瘤生长情况。(C、D)流式细胞术检测肿瘤浸润性CD8+T细胞(C)和IFN-γ+CD8+T细胞(D)。(E)与(A)中CD4+或CD8+T细胞消耗相同的实验设计。肿瘤生长曲线。(F)不同浓度WSMM刺激下CD8+T细胞产生IFN-γ。
2.短链脂肪酸丁酸促进抗肿瘤免疫反应
为了确定肠道微生物代谢物中哪些特定成分能促进抗肿瘤免疫，研究人员对接受或不接受ABX治疗的荷瘤小鼠结肠内容物样本进行了高通量代谢组学分析。与ABX未处理组相比，检测到的代谢物约有四分之三下降（图2A）。减少的代谢产物涉及许多对宿主生理至关重要的代谢途径，许多也存在于肠道微生物代谢产物中，这些代谢产物挽救了ABX治疗小鼠的抗肿瘤作用（图2B-2D）。接下来，研究人员收集了一系列在ABX处理小鼠中显著减少的肠道微生物代谢物，并筛选它们对CD8+T细胞的影响。在63种代谢物中，丁酸对CD8+T细胞产生IFN-γ的促进作用最强。提示丁酸可能介导肠道菌群的抗癌作用。
为了证实丁酸盐在抗癌治疗中的作用，研究人员在ABX干预的小鼠的饮用水中加入丁酸盐，然后肿瘤植入和oxaliplatin治疗。在饮用水中预防性口服丁酸盐也可以改善癌症的进展（图2G）并改善CD8+T细胞的免疫反应（图2H、2I）。
综上，数据表明丁酸调节抗肿瘤CD8+T细胞反应，可能在化疗中有益。
Fig2丁酸盐通过调节CD8+T细胞反应来介导抗癌作用(A)有/无ABX处理的小鼠结肠内容物中肠道微生物代谢物的代谢组学分析。(B)ABX处理后结肠含量中减少的肠道微生物代谢物(10倍)的成分。(C)ABX处理后减少的肠道微生物代谢物与补充了WSMM的ABX处理小鼠比较(10倍)。(D)选择的代谢物减少(倍)和增加(80倍)。(E)不同代谢物处理后CD8+T细胞产生IFN-γ。(F)实验设计:水、ABX或ABX+NaBu处理后的小鼠接种Mc38细胞，然后接受奥沙利铂治疗。(G)监测肿瘤生长情况。(H和I)流式细胞术检测肿瘤浸润的CD8+T细胞(H)和IFN-g+CD8+T细胞(I)。
3.丁酸盐直接促进了CD8+T细胞在体内和体外的抗肿瘤反应
为了进一步证实丁酸对CD8+T细胞的直接作用，用α-CD3/CD28和IL-12对卵清蛋白(OVA)特异性的OT-ICD8+T细胞进行体外活化，并给予低剂量(1mM)丁酸过夜处理。结果表明，低剂量丁酸过夜处理可促进CD8+T细胞产生IFN-γ和颗粒酶B（图3A）。这些OT-ICD8+T细胞的免疫能力在其对EG7肿瘤细胞（表达OVA的EL4小鼠淋巴细胞）杀伤作用中进一步证实。与预期的一样，短期丁酸处理显著提高了抗原特异性CD8+T细胞的细胞毒性能力（图3B）同时颗粒酶B产量的增加(图3C)。
为了研究丁酸是否也能在体内促进CD8+T细胞的增殖，体外丁酸刺激的OT-ICD8+T细胞转入EG7荷瘤小鼠（图3D）。丁酸盐体外处理显著提高了体内OT-ICD8+T细胞的抗肿瘤作用（图3E），并且显著增加了CD8+T细胞瘤内积累和IFN-γ的产生(图3F)。综上数据表明，丁酸处理可以直接调节CD8+T细胞的功能，促进抗肿瘤免疫。
Fig3丁酸直接增强CD8+T细胞抗肿瘤的细胞毒性功能(A)流式细胞术检测IFN-γ+和颗粒酶B+CD8+T细胞。(B和C)丁酸处理或对照OT-ICD8+T细胞与EG7细胞以不同比例共培养。显示了CD8+T细胞(B)的细胞毒性功能和颗粒酶B的产生(C)。(D)丁酸盐处理或对照OT-ICD8+T细胞转入EG7荷瘤小鼠。(E)肿瘤生长曲线。(F)流式细胞术检测肿瘤浸润的OT-ICD8+T细胞和dLN中IFN-g+OT-ICD8+T细胞。
4.丁酸对肿瘤浸润性CD8+T细胞的促进作用需要ID2
为了了解丁酸如何调节CD8+T细胞，研究人员用RNA测序(RNA-seq)分析了丁酸处理和未处理的CD8+T细胞。在丁酸处理后，许多效应T细胞相关基因上调，包括Gzma、Gzmb、Ifng、Tnf和Il12rb2，而一些记忆和耗竭相关基因，如Il7r、Cd和Il27ra下调（图4A、4B），提示丁酸不仅可以促进CD8+T细胞的活化，而且可以防止其衰竭。转录因子(TFs)是细胞分化和功能的关键。同样，调节CD8+T细胞分化和功能的经典TFs在丁酸刺激后也会上调，如Tbx21、Eomes、Batf3和Runx3（图4A、4B）。在CD8+T细胞中，一对转录调控因子ID2和E2A(由Tcf3编码)也受到丁酸的显著调控(图4A和4B)。ID2可抑制E2A与DNA的结合，拮抗E2A的转录活性，ID2和E2A参与了许多免疫细胞的分化，但它们在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中的作用仍不清楚。为了测试ID2在TILs中的作用，研究人员从共肿瘤浸润淋巴结中分离了肿瘤浸润CD8+T细胞，原始（CD44-CD62L+），活化（CD44+CD62L-）和记忆（CD44+CD62L+）CD8+T细胞，并检测ID2的表达水平。结果发现肿瘤浸润性CD8+T细胞中ID2的表达明显高于原始、活化或记忆性CD8+T细胞(图4C和4D)。结合丁酸干预后ID2表达增加以及E2A表达抑制（图4A和4B）。这些数据使研究人员推测，ID2可能在CD8+T细胞免疫中发挥重要作用，特别是在TME中，丁酸可能通过ID2依赖的途径促进CD8+T细胞应答。
为了验证此假设，研究人员将Id2flox/flox小鼠(WT)与CD4-cre小鼠杂交，获得CD4+和CD8+T细胞中ID2有条件缺失的小鼠(Cd4creId2fl/fl;KO)，进一步与CD45.1+OT-ITCR转基因小鼠杂交。将ID2充足和ID2不足的OT-ICD8+T细胞分离出来，分别在体外用丁酸或不加丁酸处理，然后与EG-7细胞共培养。与之前的结果一致(图3B和3C)，丁酸显著提高了WTCD8+T细胞反应，但在ID2缺陷组失败(图4E和4F)。
此外，丁酸盐处理的WTOT-IT细胞过过性转移对肿瘤生长表现出更明显的抑制作用，而丁酸盐对ID2KOOT-IT细胞则没有这样的作用（图4G）。丁酸也不促进肿瘤浸润或ID2KOOT-IT细胞的功能（图4H），说明丁酸对肿瘤浸润性CD8+T细胞的促进作用需要ID2。
综上数据证明了ID2在CD8+T细胞的肿瘤浸润和功能中起着至关重要的作用，丁酸的抗肿瘤作用依赖于ID2在CD8+T细胞中的表达。
Fig4丁酸通过ID2依赖途径影响CD8+T细胞(A)CD8+T细胞经或不经NaBu处理后，用RNA-seq分析。(B)通过qPCR检测丁酸处理后的CD8+T细胞中各种基因的表达。(C)分离不同亚群的CD8+T细胞，并显示ID2表达。(D)OT-ICD8+T细胞转移到EG7荷瘤小鼠。对OT-ICD8+T细胞的不同亚群进行分类，采用qPCR检测ID2的表达。(E和F)WTOT-I和ID2-KOOT-ICD8+T细胞经NaBu处理后与EG7细胞共培养。检测了CD8+T细胞(E)的细胞毒性功能和颗粒酶B(F)的生成。(G和H)WT和ID2-KOOT-ICD8+T细胞也被转入EG7荷瘤小鼠。(G)肿瘤生长曲线。(H)检测肿瘤浸润性OT-ICD8+T细胞和dLN中IFN-γ+OT-ICD8+T细胞。
5.ID2通过IL-12信号调节CD8+T细胞的功能
为了进一步了解ID2在抗肿瘤反应中是如何控制CD8+T细胞的，研究人员对从荷瘤小鼠来源的WT和ID2KOCD8+T细胞进行了RNA测序分析（图5A）。与WTCD8+T细胞相比，ID2KO条件下中许多CD8+T细胞效应基因下调，包括Ifng、Gzma、Gzmb、Klrg1和Tbx21(图5A和5B)，这表明ID2是CD8+T细胞在肿瘤侵袭时激活所必需的。在ID2KOCD8+T细胞中，这些下调的基因中很多都是丁酸处理后诱导的相同基因(图5C)，这进一步表明丁酸通过ID2促进了CD8+T细胞的细胞毒功能。CD8+T细胞中ID2缺失也导致IL-12受体（肿瘤免疫中至关重要）表达显著降低(图5A-5C)。研究人员据此提出丁酸和ID2可能通过IL-12依赖途径调节CD8+T细胞。当WT和ID2KOCD8+T细胞都从原始小鼠中分离出来，并且只在体外用α-CD3/CD28处理时，它们在IFN-γ和颗粒酶B的生成方面没有显著差异(图5D)。虽然丁酸单次处理显著提高了WT和ID2KO细胞中IFN-γ和颗粒酶B的产量，但与ID2KO细胞相比，丁酸单次处理诱导了WTCD8+T细胞中IL-12R的表达，说明丁酸可通过ID2调节IL-12R的表达。IL-12处理，特别是IL-12加丁酸盐处理，显著提高了WTCD8+T细胞反应，但在ID2KO组无此反应(图5D)。此外，T-bet也表现出与效应细胞因子相似的模式(图5D)。数据表明，ID2通过调节IL-12信号通路促进CD8+T细胞的细胞毒性功能，丁酸通过调节ID2依赖的IL-12通路提高CD8+T细胞的功能。
此外，ID2对IL-12诱导的CD8+T细胞的增殖也是必要的(图5E)。IL-12阻断显著抑制了丁酸处理的OT-ICD8+T细胞体内的肿瘤浸润和抗肿瘤疗效(图5F和5G)，提示丁酸盐介导的抗肿瘤作用依赖于IL-12信号。因为ID2可以与E2A结合并拮抗其转录活性，我们接下来研究E2A是否调节IL-12受体的表达。染色质免疫沉淀和荧光素酶分析显示，E2A直接与Il12rb2位点结合并抑制其表达，ID2缺失进一步促进了E2A的抑制作用（图5H-5I）。总之，以上数据表明，丁酸和ID2通过修饰IL-12信号促进了CD8+T细胞的抗肿瘤免疫。
Fig5ID2通过IL-12信号调节CD8+T细胞
(A)化疗后WT和ID2KO荷瘤小鼠CD8+T细胞RNA-seq分析。(B)CD8+T细胞中Ifng、Gzmb和Il12rb2的表达通过qPCR验证。(C)CD8+T细胞内ID2调控基因和丁酸诱导基因的RNA-seq数据比较分析。(D)WT和ID2KOCD8+T细胞被IL-2和α-CD3/CD28激活并扩增，然后用NaBu或IL-12处理。CD8+T细胞mRNA表达分析。(E)CD8+T细胞经α-CD3/CD28(含IL-12或不含IL-12)活化后，用CFSE稀释法检测CD8+T细胞的增殖情况。(F和G)NaBu处理过的OT-ICD8+T细胞被过继转移到携带EG7的小鼠中，进行对照或α-IL-12抗体处理。(F)肿瘤生长曲线。(G)肿瘤浸润的OT-ICD8+T细胞。(H)ChIP-qPCR检测E2A蛋白与Il12rb2启动子的结合。Tcf7启动子作为阳性对照。(I)单独或含有Il12rb2启动子的载体，以及空载体或表达E12的载体转染T细胞的荧光素酶活性。
6.补充丁酸盐可提高抗肿瘤疗效
接下来，研究人员测试了丁酸盐作为癌症治疗的一部分是否有效。ABX处理的小鼠在肿瘤接种后腹腔注射丁酸盐(图6A)，这也显著提高了丁酸盐水平(图S7A)。肿瘤建立后给予丁酸也挽救oxaliplatin对ABX治疗小鼠的疗效(图6B)。
为了检测丁酸盐在自发性肿瘤中的作用，研究人员使用了带有偶氮甲烷(AOM)和右聚糖硫酸钠(DSS)的结肠炎相关结肠直肠癌(CAC)小鼠模型(图6C)。AOM和DSS处理诱导结肠肿瘤形成(图6D)。oxaliplatin显著降低了肿瘤负荷(图6D)。同样，丁酸并挽救了oxaliplatin对微生物破坏小鼠的疗效(图6D)。
研究人员还研究了在没有ABX治疗下，丁酸是否可以改善小鼠化疗。荷瘤小鼠分别口服oxaliplatin或与丁酸盐合用(图6E)。oxaliplatin和丁酸联合治疗更有希望肿瘤消退(图6F)。此外，丁酸也提高了α-PD-L1治疗的疗效(图6G和6H)。
总之，以上数据证明，丁酸盐和化疗或免疫制剂联合治疗显示出更强的肿瘤抑制作用，这表明肠道微生物代谢物可能对未来的癌症治疗有影响。
Fig6丁酸盐补充可提高抗肿瘤治疗的疗效(A和B)水处理或ABX处理的小鼠接种Mc38细胞，接受奥沙利铂治疗，丁酸盐腹腔注射或不注射。观察肿瘤生长情况。(C、D)AOM-DSS小鼠在疾病诱导后饮水中加入ABX，然后给予奥沙利铂和NaBu治疗。小鼠结肠和息肉的代表性图像显示。(E和F)接种Mc38细胞的小鼠饲喂对照或含丁酸盐的膳食HAMSB，奥沙利铂处理。观察肿瘤生长情况(G和H)小鼠接种Mc38细胞，腹腔注射α-PD-L1抗体和丁酸盐。
7.丁酸盐的量与oxaliplatin在人类癌症患者中的疗效相关
研究人员进一步收集了oxaliplatin治疗的癌症患者的血清样本(表S5)，并检测了丁酸盐水平。对oxaliplatin有反应的癌症患者的血清显示出比无反应患者更高的丁酸盐丰度(图7A)。此外，丁酸可诱导从健康志愿者中分离的人CD8+T细胞表达ID2和IFN-γ(图7B)，ID2表达水平与IFN-γ表达水平呈正相关(图7C)。表明丁酸盐也可能促进抗癌免疫和oxaliplatin在人类的疗效。
Fig7癌症患者的丁酸量与奥沙利铂疗效相关(A)测量并比较了奥沙利铂有应答者(部分应答或病情稳定)和无应答者(进展或死亡)癌症患者的血清丁酸。(B和C)CD8+T细胞从健康志愿者中分离，用α-CD3/28和IL-2培养，然后用NaBu处理。(B)qPCR检测ID2和IFN-γ的表达。(C)CD8+T细胞ID2和IFN-γ表达水平的相关性分析
总结
研究人员发现丁酸盐通过促进IL-12信号通路，在体外和体内以ID2依赖的方式直接提高了抗肿瘤细胞毒性CD8+T细胞的反应。在人类中，对奥沙利铂有应答的肿瘤患者比无应答的肿瘤患者血清丁酸含量更高，这也可以增加人类CD8+T细胞ID2的表达和功能。研究结果表明，肠道微生物代谢物丁酸盐可以通过ID2依赖性调节CD8+T细胞免疫来促进抗肿瘤治疗效果，提示肠道微生物代谢物可以作为癌症治疗的一部分。
撰文：毛姝英
排版：刘珂安琪
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