研究背景
益生菌疗法已成为医学研究的主流，因为它在恢复肠道微生物、微环境和免疫系统之间的平衡方面具有显著优势。然而，如何通过简单有效的策略在整个复杂的胃肠道条件（GIT）下有效地传递和维持益生菌活性仍然是一个挑战。孢子作为益生菌的休眠生命形式，由于其在胃中具有很强的抵抗力，在肠道中萌发，可用于益生菌的输送。然而孢子的萌发效率在体内不能得到很好的控制和一些离子在孢子萌发时分泌到肠道，这可能会破坏肠道离子稳态。虽然孢子本身的缺陷限制了其在益生菌治疗中的应用，但具有高抗性的孢子衣为口服益生菌的传递提供了可能。
工作介绍
近日，郑州大学张振中、张云和王蕾研究团队创新性地开发了一种简单的策略，通过体外机械力挤压将孢子壳转化为多功能孢子壳纳米颗粒（CN），进一步通过锚定CN构建了一系列微生态制剂，在不同的益生菌表面形成功能性的“盔甲”。CN包被的益生菌能够在治疗结肠炎和预防结肠炎相关癌症（CAC）方面具有优越的效果。这种仿生设计策略可能为开发功能性纳米材料和基于材料的平台提供一种新的方法。
1.CN具有高耐受性、良好的生物相容性和钙离子含量，通过修复上皮屏障和抑制典型的促炎因子如IL-1β、TNF-α、IL-6等表现出优越的抗炎作用。
2.CN通过阻断IL-6-STAT3信号通路阻止结肠炎相关癌（CAC）的发生。
3.CN可以特异性靶向益生菌，CN包被的益生菌可以抵抗口服给药后严酷的GIT环境。
4.一旦到达肠道，由于CN提供的营养物质，CN包被的益生菌迅速进入对数生长期，从而抑制有害细菌，有效地在结肠内定植。
Scheme1.制备CN
BC的工艺示意图和治疗结肠炎该工作发表在Adv.Funct.Mater.上，IF=18.。
研究思路
论文导读
Figure1.孢子CN的制备及特性
Bacilluscoagulans（BC）在产孢培养基中培养48小时，从BC中分离出1-2μm的纯孢子（Figure.1a-b），然后通过脂质体挤出器制备CN，制备的CN具有均匀的粒径，且具有良好的稳定性（Figure.1c-e）。CN中含有大量的钙离子，这可能与上皮屏障的修复有关，锰、镁离子可为益生菌的爆发性增殖提供额外的活性物质（Figure.1f）。葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎与活性氧（ROS）产量的增加有关，当Caco-2细胞暴露于DSS时，ROS显著增加（Figure.1g）。而CN可以降低ROS水平，减轻H2O2引起的细胞损伤（Figure.1h）。紧密连接的破坏是DSS诱导结肠炎的主要特征。结果表明，CN能阻止E-cadherin和ZO-1的丢失，并能阻止H2O2引起的跨细胞上皮电阻值的早期功能障碍（Figure.1i-j）。
Figure2.CN
BC的制备及特性研究为了确认CN是否可以锚定在BC表面制备CN包被的益生菌（CN
BC），将CN和BC共孵育在生长培养基中（Figure.2a）。随着孵育时间的延长，可以明显观察到CN包被在BC表面，在6h时CN的吸附几乎达到饱和状态（Figure.2b），SEM同样显示了CNBC的成功制备（Figure.2c）。在制备过程中记录了混合介质（CN+BC）在nm处的OD值CNBC。CN+BC的ODnm值在孵育开始时高于BC，但两组菌数相等，孵育6h后，CN+BC的ODnm值开始呈指数增长表明了CNBC在6h内可以有效地形成（Figure.2d）。且CN不会对BC的增殖活性产生不利影响，甚至促进了BC的生长（Figure.2e）。在模拟胃肠环境中评估了BC和CNBC的存活率和生长效率。在SGF中孵育2小时后，BC组和CNBC组几乎看不到生长，因为益生菌在严酷的胃环境中很难生长，然后样品在SIF培养基中孵育，CNBC的生长活力显著提高，证实了CN能有效保护BC，增强其体外增殖（Figure.2f）。进一步考察CNBC是否能够抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长，与单独使用CN或BC相比，CNBC能明显抑制两种细菌的增殖（Figure.2g-h）。Figure3.对CN
BC在健康小鼠体内的行为评价优良的定殖和增殖效率是益生菌发挥作用的先决条件。首先考察不同剂量的益生菌在健康小鼠体内的定殖效果。在CN
BC组中观察到大量的益生菌定植，而在BC和CN处理组中检测到很少的定植，说明CN可以有效保护BC免受GIT恶劣环境的影响（Figure.3a）。在孢子组中检测到高组织学评分和一些病理变化，如结缔组织增生（黑色箭头）、淋巴细胞和中性粒细胞的斑点浸润（黄色箭头），而在其他治疗组中未发现明显的炎症（Figure.3b）。除孢子组结肠较短外，其他处理组结肠长度与生理盐水组相似，证明孢子可引起结肠炎症（Figure.3c）。较高的髓过氧化物酶（MPO）活性也表明孢子处理后发生了一些炎症反应（Figure.3d）。与孢子组相比，CNBC可在健康小鼠结肠内高效定植，且对其生理条件无不良影响，生物安全性高。为了研究CNBC对肠道屏障的调节作用，健康小鼠分别灌胃生理盐水、BC、孢子、CN和CNBC处理48h后，各组均有较厚的黏液层，可维持肠屏障的完整性和黏膜稳态（Figure.3e）。Figure4.CN
BC对结肠炎模型小鼠的治疗效果评价基于CN
BC对健康小鼠的良好作用，进一步评价其对DSS诱导结肠炎小鼠模型的治疗效果（Figure.4a）。革兰氏染色结果显示，经CNBC治疗后，大量益生菌定植于结肠内，这得益于CN的防御功能（Figure.4b-c）。与健康小鼠的结果相似，CNBC的定殖率也高于孢子处理组，这可能是由于孢子虽然能抵抗胃酸环境，但其在肠道中的萌发和定殖效率难以控制。结肠炎的发病机制源于肠道微生物、环境和免疫系统之间的一系列复杂的相互作用，因此，进一步研究了CNBC治疗是否可以通过调节肠道微生物群来影响结肠炎。CNBC组处理后的结肠微生物群落的丰富度和多样性显著提高（Figure.4d）。经过CNBC治疗后，结肠炎小鼠体重迅速恢复至正常小鼠，BC和孢子处理组体重均有不同程度的下降，且CNBC组结肠长度与正常小鼠相似，明显长于BC治疗组（Figure.4e-f）。经CN和CNBC治疗后，DAI评分和结肠MPO活性的增加明显受到抑制CNBC（Figure.4g）。CN和CNBC中结直肠组织具有代表性的HE染色中仅出现轻微坏死细胞碎片，其余治疗组出现不同程度的病理损伤，如淋巴细胞和中性粒细胞浸润（红色箭头）和结缔组织增生（黄色箭头），而组织病理学评分也显示了各组组织炎症程度的不同，表明CN和CNBC治疗后炎症/黏膜损伤明显减轻（Figure.4h）。紧密连接相关蛋白ZO-1在孢子组和CNBC组中表达增加，而CNBC组Occludin的表达低于孢子组，这可能与孢子萌发过程中释放的钙离子增强紧密连接有关（Figure.4i）。Figure5.评价CN
BC对CAC小鼠模型的预防作用随后，进一步研究了CN
BC是否可以提高对CAC小鼠的预防效果（Figure.5a）。BC和孢子处理组的小鼠体重明显增加较少，CN和CNBC处理组的CAC小鼠体重也有所增加，证明CN和CNBC可显著阻断DSS诱导的结肠炎（Figure.5b）。在第3个预防周期中，在CNBC组中检测到最低的DAI得分，表明其能够有效抑制CAC，结肠长度增加和息肉数量减少也证实了这一结果（Figure.5c-d）。此外，CNBC组中结肠MPO活性和炎性细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）也受到抑制和下调（Figure.5e-f）。以上结果均表明CNBC可抑制DSS诱导的结肠炎的发展，为肿瘤的预防提供了一种有前景的策略。慢性炎症是癌症发生发展的重要驱动因素，异常激活STAT3信号通路可导致肿瘤细胞增殖周期紊乱，抑制细胞凋亡，从而诱发恶性肿瘤的发生。因此，STAT3及其下游通路的调控对于CAC的预防治疗至关重要。与其他各组相比，CN或CN
BC处理明显抑制了IL-6和STAT3信号通路（Figure.5g）。WB分析表明CNBC能有效地恢复肠道屏障的完整性，有助于抑制CAC过程（Figure.5h）。除了CNBC治疗组、其他治疗组均出现不同程度的病理损害，如粘膜糜烂（黑色箭头）、炎性细胞浸润（红色箭头）、腺体杯状细胞减少（绿色箭头），表明CNBC通过减少DSS引起的上皮损伤和炎症浸润，可显著保护结肠结构的完整性（Figure.5i）。TUNEL实验也证实CNBC能够诱导大量的肿瘤细胞凋亡（Figure.5j）。Figure6.CN
BC对肠道微生物群组成和丰度的调控随后，考察CN
BC治疗是否可以通过调节CAC模型中肠道微生物群的组成来加速治疗过程。首先，物种累积箱线图证明了本研究的样本量足以进行进一步的物种丰富度分析（Figure.6a）。从OTUs、shannon和chao1指数来看，CN和CNBC处理后的微生物区系丰富度和多样性显著提高（Figure.6b）。CNBC治疗显著提高了乳酸杆菌的相对丰度，降低了嗜粘液阿克曼菌（已知与肠道肿瘤的发生有关）的相对丰度，这对CAC的预防至关重要（Figure.6c-d）。基于UniFrac距离主坐标分析和非度量多维标度（NMDS）对beta多样性的评估显示，CNBC处理呈现了微生物群组成的集中聚类，与健康小鼠相似（Figure.6e）。Tax4fun功能注释聚类热图显示经CNBC治疗可降低与肿瘤发生发展相关物种的相对丰度，CNBC治疗组的微生物群组成和功能与健康小鼠相似，说明CNBC对CAC有良好的预防作用。（Figure.6f）。论文亮点
1.通过简单的脂质挤出器制备了粒径均匀的CN，用于保护益生菌。
2.在整个使用期间，益生菌被以被CN有效保护，降低胃肠环境的影响。
3.可以增强益生菌固有的生物活性和定殖能力。
4.制备的CN
BC能够促进肠道共生菌群稳态和屏障完整性的恢复。5.由于孢子结构相似，这种制备CN的方法可应用于多种益生菌。
6.本研究为开发新型生物材料和生物材料基CN包被的益生菌提供了一种简单、有效、普遍的策略。
文献链接
QinglingSong,HongjuanZhao,CuixiaZheng,KeWang,HuiGao,QianhuaFeng,HonglingZhang,ZhenzhongZhang*,YunZhang*,andLeiWang*.
ABioinspiredVersatileSporeCoatNanomaterialforOralProbioticsDelivery.Adv.Funct.Mater.,.DOI:10./adfm.04994.
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