时间：-06-：00—20：30
地点：线上腾讯会议
参加人员：杨二鹏、杨嘉欣、黄婷、郭延彤、何亚琳、孙适然、徐楠、袁淳晟、邵文博、孙小梅、王佳聪、王玉坤、郝北辰、周琼、张菁菁
请假人员：马慧淼、夏中颖、阿丽·赛力克
报告人：王玉坤（九年制本硕博连读大五）
记录人员：何亚琳
学习主题：液体活检
一、液体活检含义
术语“液体活检”指的是通过使用可从癌症患者的体液（包括外周血）中分离出的肿瘤衍生生物标志物进行肿瘤分子分析的可能性。液体活检的不同应用中，循环肿瘤DNA（ctDNA）的分析是现临床实践中唯一采用的方法。尤其是，ctDNA测试可以检测与敏感性或对靶向剂的抗性相关的遗传改变。
分类
液体活检它主要检测5种东西，分别是循环肿瘤细胞（circulatingtumourcells，CTCs）、循环游离DNA（circulatingcell-freeDNA，cfDNA）、细胞外囊泡（extracellularvesicles，EVs）、循环游离RNA（circulatingcell-freeRNA，cfRNA）以及蛋白质和代谢产物。
二、循环肿瘤DNA（ctDNA）检测
循环肿瘤DNA（circulatingtumourDNA，ctDNA）是cfDNA之一，它的检测至关重要。
1.起源
年，研究人员就发现人体细胞内的DNA并不是都待在细胞核内，这些DNA也会游离到血液中来，这些在血液中的DNA就被称之为cfDNA。循环肿瘤DNA是一种存在于血浆或血清、脑脊液等体液中的细胞外DNA，是循环游离DNA中的一类，占比约为0.1%-1%，主要来自于坏死或凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞分泌的外排体及循环肿瘤细胞。ctDNA片段大小通常为-bp，在血液中半衰期2小时，携带有SNP（点突变）、InDel（插入缺失）、CNV（拷贝数）、fusion（融合基因）等突变信息，在人体血液循环系统中不断流动，可实时反映肿瘤患者当前信息。
2.ctDNA检测的优势
ctDNA的检测属于超早期的癌症筛查技术，对于患者而言主要具备三个很大的优势：1）无创、实时、全面，以高通量捕获测序为基础的ctDNA检测，可以实现无创、实时、全面地揭示比组织样品检测更多的全身多病灶突变信息。因为ctDNA可能来自于凋亡细胞，因此它可能代表肿瘤细胞的特定亚型，同时还能提供肿瘤基因组的全景视图，因为它反映了从多个肿瘤区域或不同肿瘤病灶释放的DNA信息，对其的分析可以发现组织活检中无法发现的体细胞突变；2）超早期：ctDNA可以在超早期，在常规手段无法检测到的情况下检测出是否有细胞癌变的可能性。这个时候的人群可能处于亚健康状态，通过超早期的检测可以提前预警，通过生活方式的改变比如说戒烟禁酒或者其他方式消除安全隐患；3）全程：ctDNA不仅可以用于肿瘤的超早期检测和预防，同时在肿瘤发生发展的全过程中都可以发挥出自己的作用，实现肿瘤患者的全程诊疗管理。那么它是如何实现整理患者全程诊疗管理的？我们可以通过下图说明：
首先ctDNA检测可以在超早期判断人群可能处于亚健康状态，有癌变倾向，或者已经患有癌症；其次可以对患者进行肿瘤细胞分子分型，还可以监测残余的病变；在实施了不同的治疗方案，比如手术或者不同的化疗方案之后，通过监测疗程和克隆的进化，来判断这个方案疗效如何，或者患者有没有发生转移或者进一步病变，或者说是趋向稳定的情况等。
由于ctDNA检测对于患者来说具备优势，这使它成为精准肿瘤学的潜力标志物，和组织活检对比，ctDNA检测主要具备以下5个优点：1）第一，ctDNA能够反映多个肿瘤区域或不同肿瘤病灶释放的DNA信息，因此它能够提供对肿瘤基因组的综合描述；2）第二，ctDNA的深度测序可以发现肿瘤内异质性和只在部分细胞中出现的基因突变；3）第三，ctDNA可以提供肿瘤大小的信息，从而反映出疾病的发展状态和对疗法的反应。研究报道显示在非小细胞肺癌和高级别浆液性卵巢癌中肿瘤体积和ctDNA血浆突变的VAF之间呈线性关系；（VAF：Variantallelefrequency，变异等位基因频率，ctDNA中的突变变异等位基因频率提示原发灶和转移灶中携带特定变异肿瘤克隆的频率，成为肿瘤负荷的替代指标。）4）第四，ctDNA具备预测预后的价值，对于患有局部肿瘤和/或化疗的结肠癌/卵巢癌/肺癌患者中，在治疗性手术后，ctDNA的存在被证明是与患者的复发和不良结果相关的强有力的预后标志物；5）第五，ctDNA是能够发现肿瘤抗性的标志物，文章中也有记载，如接受抗EGFR治疗的CRC患者出现的KRAS突变，在用各种疗法治疗的乳腺癌患者中，PIK3CA、MED1或EGFR等基因的VAFs的增加，用EGFR靶向药TKI治疗肺癌患者的EGFRTM耐药突变。
除了这些优点，ctDNA检测对于检测人员而言也具备优势：首先是取样方便，它是无创无损、实时多次的，而且容易获取。ctDNA检测只需抽取患者血液即可完成对肿瘤细胞DNA的分析与解读，避免穿刺、手术等有创方式采集肿瘤组织的风险，一定程度上缓解了医患矛盾纠纷；其次，它的检测技术成熟，灵敏度高、准确度高、假阳性率低，利用NGS法检测ctDNA，灵敏准确，可检测到低至0.1%的低频突变。能够为肿瘤个体化治疗呈现较全面的分子生物学特性，是一种理想的肿瘤标志物；第三点是它检测全面，应用范围广，几乎所有的肿瘤细胞都可以将DNA片段释放到血液中，因此ctDNA能够体现患者体内肿瘤的综合情况。
3.ctDNA检测面临的挑战
尽管ctDNA检测有很多优点，但它仍然存在问题和挑战。目前公布的ctDNA检测数据主要集中在主流癌种，如肺癌和结直肠癌，而针对发病率偏低的癌症类型其研究相对较少。另外，作为检测金标准的肿瘤组织，ctDNA面临着与组织一致性的问题。
年发表在SciRep.的一篇研究采集了30例Ⅰ-Ⅱ期和11例Ⅲ-Ⅳ期非小细胞肺癌患者的术前0-13天（平均3.9天）外周血、手术组织和术后2-10天（平均5.1天）外周血样本，使用CA50panel(包含了50个与肿瘤用药、致癌基因通路及肿瘤检测相关基因的个热点突变)，通过IonTorrentProton检测平台、深度测序（10,x），对血浆ctDNA和组织tDNA突变情况进行了比较。结果显示，检测到30例早期（Ⅰ-Ⅱ期）非小细胞肺癌患者血浆ctDNA的常见驱动突变，并且与组织tDNA高度一致，其中，一致性为80.0%，敏感性为75%，特异性90%，阳性预测值93.8%,充分说明了它存在的问题。我们通过表格整理组织tDNA和ctDNA的区别：
（注：首先就肿瘤负荷来说，固体活检取得组织的大小就反映了肿瘤大小的负荷，ctDNA是依靠刚才提到的VAF提示肿瘤的负荷；关于亚型分类，固体活检主要基于组织学，有一些也是基于表达谱，但是ctDNA是基于组织解卷积（解卷积，Deconvolution，是指从异构样本中提取细胞类型特异性信息的过程。在液体活活检中，这可能涉及将血浆DNA片段分解成其构成要素，例如，基于甲基化标志物确定其组织起源。）还有关于肿瘤的进化，对于固体活检来说是比较难评估的，因为它不能纵向取样，对于ctDNA来说，它的纵向取样可以轻而易举地实现肿瘤进化的观察。）
除了组织一致性以外，还有一个难点，血液中的ctDNA通常在数量上远远少于非癌cfDNA，因此分析ctDNA时的瓶颈问题在于如何从正常细胞cfDNA背景下检测到罕见的ctDNA片段。另外，ctDNA的半衰期短，占比少，cfDNA的半衰期就只有1-2个小时，在外周血中处于动态的不断变化的过程，其表达量取决于产生cfDNA的来源。血浆中总cfDNA含量低，ctDNA仅为cfDNA中很小的一部分，虽然ctDNA在cfDNA中的占比波动范围非常大，但实际上大多数ctDNA在cfDNA中的占比约0.2%。再者就是ctDNA具有高度碎片化的特点，在血液中是以裸露核酸的形式存在，这也从另一侧面提示它们可能源于凋亡进程中核小体所含的核酸片段。
那么如何解决这个问题？主要通过提高测序方法的分析灵敏度，解决ctDNA低起始量的最新技术发展集中于提高测序方法的分析灵敏度上，但这可能受到血浆cfDNA提取、测序文库制备、测序过程中引入错误等影响。通常使用UMIs(uniquemolecularidentifiers/barcodes)可以减轻这些因素带来的问题。靶向错误校正测序（TEC-Seq，TargetedErrorCorrectionSequencing）是一种基于UMI的测序方法，可检测结直肠癌，肺癌，卵巢癌和乳腺癌患者血浆ctDNA中的常见突变基因，其中，超过75％的患者可以检测到至少1个突变。也可以在检测中通过进一步提高分析灵敏度来解决上述问题。临床实践中的解决方法之一是通过显著增加样本体积（即采集肿瘤患者更多的血液）来增加可检测分子的数量，但这种方法在晚期疾病患者中通常不具有临床可行性；或者通过大量血浆样本突变检测来确定被定义为肿瘤突变阳性所需的最小检测突变数，从而弥补ctDNA的低起始量。第三个办法就是不从提高灵敏度的方向考虑，即富集ctDNA片段，其他增加分析灵敏度的尝试集中在基于ctDNA/cfDNA的长度来富集ctDNA片段。近年来许多研究表明，ctDNA和cfDNA的片段长短存在差异：cfDNA~bp，ctDNA则为~bp。最近的一项研究表明，DNA片段长度可能因核小体在原始组织中的可及性而产生差异。通过上述提高灵敏度以及富集ctDNA片段可以看出，对于cfDNA的研究对于解决瓶颈问题起了至关重要的作用。
4.cfDNA
随着技术的发展，在孕妇和癌症患者血浆中发现的胎儿和肿瘤cfDNA给基于血液的非侵入性产前检测（NIPT）和癌症基因检测开辟了许多新的可能。到目前为止，NIPT已被用于胎儿RhD血型基因分型，性别相关疾病的胎儿性别测定，染色体非整倍性检测和单基因疾病的诊断，特别是常染色体非整倍体的NIPT已被迅速用于90多个国家的临床服务。目前，cfDNA的释放机制和生物学基础还尚不明确。一般认为cfDNA起源于坏死或凋亡的细胞。坏死的细胞被巨噬细胞等吞噬，然后释放经过消化的DNA到血液中形成循环游离DNA。在实体瘤中，肿瘤组织快速生长，因养分供应不足等原因导致细胞死亡，释放DNA到患者的外周血中，这些源于肿瘤细胞的cfDNA被称为ctDNA，携带肿瘤细胞的突变信息。甲基化分析表明，健康人的cfDNA来源于血液中的细胞。
5.cfDNA的检测方法
如果检测ctDNA首先就要有能力检测cfDNA，对于cfDNA的检测方法主要是以下4个：1）基于实时荧光定量PCR（qPCR）技术：荧光定量PCR是检测拷贝数变化的一种快速且经济的技术方法，该方法技术可用于RNA表达水平检测该技术主要优点是检测快速、通量高、灵敏度好，检测成本相对较低。主要不足是对肿瘤组织提取RNA的质量要求较高，在检测基因表达量时判读标准尚未统一。在PCR技术的基础上，又发展了一些新的技术，比如说扩增阻碍突变系统（ARMS），它是PCR技术应用的发展，也称等位基因特性PCR（AS-PCR）等，用于对已知突变基因进行检测，是目前实验室常用的基因突变检测方法。还有高分辨率熔解曲线（HRM）是一种基于PCR新型技术，用于检测基因变异包括未知的基因变异、单核苷酸多态性以及基因甲基化。HRM是基于在加热过程中双链变性为单链的原则；2）基于数字PCR（dPCR）的技术：数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，对起始样品绝对定量，目前的应用包括稀有等位基因检测、基因表达绝对定量、二代测序文库绝对定量等。dPCR因不受扩增曲线Ct值、内参、标准品或标准曲线等因素的影响而具有更高的准确度、灵敏度和重复性，其检测极限可达0.%。缺陷是数字PCR仪通量较低，对于DNA浓度大的样本处理就没有优势；3）基于高通量测序（NGS）的技术；4）基于飞行质谱的技术；qPCR和dPCR在通量上都不及飞行质谱和NGS。飞行质谱已经广泛应用于核酸检测领域，如SNPs(单核苷酸多态性)、产前诊断、DNA甲基化分析、基因表达等。随着精准医疗的发展，新型ctDNA高通量测序技术/方法不断被报道。
6.cfDNA长度的分析方法
cfDNA长度的分析方法主要有4种方法：1）凝胶电泳
它的分辨率有限，不能用于区分和量化cfDNA的大小分布研究，它以bp为间隔。
2）qPCR
只能用于研究已知的序列，不能用于基因组的分析。
3）MPS/NGS
目前为止较常用的方法，NGS又称大规模平行测序（MPS），包含多种可以一次性产生大量数字化基因序列的测序技术，采用平行测序的理念，能够同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目标。高通量测序技术不仅可以进行大规模基因组测序，还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选和DNA甲基化等相关研究。其三大优点是：第一，它利用芯片进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序；第二，高通量测序技术有定量功能，样品中DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度；第三，利用传统Sanger测序法完成的人类基因组计划总计耗资27亿美元，而现在利用高通量测序技术进行人类基因组测序，测序成本只需1千美金。局限性是检测灵敏度和测序深度相关。一般来说，NGS在肿瘤体细胞突变检测时，检测灵敏度为10%；已知的与肿瘤相关驱动基因数量有限，疾病表型和基因型的关系还有赖于生物信息的解读，目前NGS应用于肿瘤细胞突变检测的标准化和质量控制尚未形成共识；
4）显微镜法：电子显微镜（Electronmicroscopy，EM）和原子力显微镜（atomicforcemicroscopy，AFM）观察DNA分子的构象和测量DNA分子的长度。使用显微镜的方法，是基于1bp=0.34nm的假设来确定cfDNA片段长度的。EM与AFM在cfDNA片段研究中的主要问题是非常耗费人力，耗时且通量低，但是是比较传统的一种方法。
7.cfDNA/ctDNA片段大小及分布规律
现有许多研究表明，来自多种病症（包括妊娠、癌症、肝/骨髓移植和系统性红斑狼疮）的受试者血浆中cfDNA片段通常比正常人短，即：来自于肿瘤的ctDNA片段长度比非肿瘤来源的cfDNA片段短；来自于胎儿的cfDNA片段长度比孕妇的cfDNA片段短；来自肝/骨髓移植和系统性红斑狼疮患者的cfDNA片段长度比正常人的cfDNA片段短；另外，相关研究发现，来自于尿液中的cfDNA片段平均长度比血浆中cfDNA片段短。相比于母体血液中的胎儿游离DNA（cffDNA），ctDNA的片段分析更具有挑战性，因为将肿瘤来源的血浆DNA（ctDNA）与血浆中非肿瘤产生的背景DNA区分开来相对较难，通过NGS的Z值分析能够检测肿瘤相关的CNV（基因拷贝数变异）变化。血浆中肿瘤DNA的含量越大，癌症患者血浆中短DNA（低于bp）的比例就越高；相反，血浆中肿瘤DNA含量越低，癌症患者血浆中长DNA的比例就越高。
8.cfDNA片段长度差异化的原因
血浆中DNA不是随机片段化的，cfDNA的大小及分布与核小体的结构密切相关。此外，血浆DNA被认为是从凋亡细胞中释放，表明裂解谱与核小体的结构和染色质状态相关，因此，值得深入研究血浆DNA的碎裂模式，并探讨碎裂机制是否与血浆DNA的大小分布有关。ctDNA片段长度差异化的解释之一是核内切割假说。核小体是由DNA和组蛋白形成的染色质基本结构单位，由核心颗粒（coreparticie）和连接区DNA（linkerDNA）二部分组成。每个核心颗粒由bp的DNA缠绕组蛋白八聚体（由四对组蛋白H2A,H2B,H3和H4组成）1.75圈形成，从晶体结构可以看出，组蛋白八聚体和双螺旋DNA每10bp即有一个结合点。连接区DNA的长度在不同物种差异较大，其均值大小约20bp，范围在从0-80bp不等。核内切割假说理论认为：在体细胞组织中，因为核小体核心颗粒内的DNA与组蛋白结合，内切核酸酶在核心颗粒内比在接头区域内切割DNA更困难。
另外一个原因是甲基化，是卢煜明教授团队提出的理论，即胎盘组织中的核小体可及性高于母体体组织（例如血细胞），从而允许内切核酸酶在细胞死亡过程（例如细胞凋亡）期间在核小体核内切割。该团队通过ATAC-seq实验表明，与血细胞相比，胎盘细胞中的转座酶更容易切割核心颗粒，并表明这种可及性的分子基础仍不清楚，猜测DNA甲基化可能是一个促成因素。既往研究表明，DNA甲基化可以诱导DNA在伴随的组蛋白周围更紧密地包裹，并增加核小体的实压、刚性和稳定性。此外，DNA甲基化还可以调节组蛋白修饰以及异染色质形成，这与核小体展开，分解和稳定性相关。同时，研究表明，与体细胞组织相比，胎盘组织表现出全基因组低甲基化现象。这些研究均提示胎盘组织中较高的核小体可及性可能与其低甲基化有关。既往研究也表明，血浆DNA的片段大小与DNA甲基化水平呈正相关；此外，在妊娠期间，胎盘基因组的DNA甲基化逐渐增加，母体血浆中胎儿来源的DNA片段大小也随着孕龄而增加；DNA甲基化可能是通过改变染色质的可及性来影响cfDNA的片段化过程。癌症患者和孕妇的血浆DNA谱之间存在显着的相似性，卢煜明教授团队认为，肿瘤来源的ctDNA片段和大小分布机制可能与cffDNA片段化机制相似，同时肿瘤基因组也表现出全基因组低甲基化。
三、总结
综上所述，我们通常所用的肿瘤组织检测也存在一些问题和难点，比如有创性、不能够全面实施的问题，因此焦点转向液体活检，相较于肿瘤组织检测，液体活检具备了无创性、实时、全面、综合的一些特点，所以它成为了精准肿瘤学的潜力标志物。但是它仍然存在问题和挑战，比如与组织一致性的问题，还有如何从正常细胞的cfDNA背景下检测到罕见的ctDNA片段。提到的方法有增高它的灵敏度，或者多采集患者的血液，还可以通过富集ctDNA片段，但是这种方法只是一种构想，因为富集ctDNA片段需要对ctDNA、cfDNA的片段分布大小规律掌握得很透彻。目前为止来说只发现了核内切割假说和关于甲基化的研究。所以说这条路还很长，但是科技的发展水平是很快的，相信很快就能研究出新的东西。
四、拓展
通过一篇文献来看液体活检到底有什么用处，这篇文献是年发表在Ann.Oncol.上的，研究称为“CAPRI-GOIM试验”，（RAStestingofliquidbiopsycorrelateswiththeout