文献来源：Mikryukov,AlexanderA.,etal."BMP10signalingpromotesthedevelopmentofendocardialcellsfromhumanpluripotentstemcell-derivedcardiovascularprogenitors."Cellstemcell28.1():96-.(PMID:)
通讯作者信息
1
摘要
胚胎心内膜对早期心脏发育至关重要，因为它起着诱导小梁心肌（形成的第一个心脏组织）的作用，并且是构成瓣膜和一部分冠状脉管系统的细胞的来源。凭借这种潜力，人心内膜细胞可以作为包括工程化生物瓣膜和基于细胞的治疗策略的工具，用以替代受损心脏中的冠状血管。为了获得人心内膜细胞，研究者通过人多能干细胞（hPSC）诱导出一类内皮细胞，该细胞显示出许多心内膜特征，包括表达体内心内膜相关基因，具备体外与心肌细胞共培养下诱导未成熟小梁命运的能力，以及能够向间充质转化（EndoMT）的能力。通过分析hPSC衍生的心内膜细胞发育所需的信号通路，确定了BMP10在心血管中胚层谱系中的新作用。2
图文摘要
3
研究背景
科学问题：心内膜细胞够诱导生成心脏多种细胞，可以用于细胞治疗的重要细胞来源。如何获得源源不断的心内膜细胞是当前面临的关键挑战；既往研究证实了多能干细胞（hPSC）能够在体外诱导生成心内膜样细胞，但不足的是，这些hPSC衍生的心内膜细胞都缺乏表达心内膜关键标记基因——NKX2-5；NKX2-5转录因子主要在前体心肌细胞中表达，是正常心脏发育的必要条件。因此，诱导出NKX2-5+CD31+心内膜内皮细胞成为本研究的直接目的。
逻辑基础：1）最原始的心脏是由内层的内皮，即心内膜和外层心肌细胞构成；2）心内膜内皮区分于其他内皮细胞（EC）在于其表达NKX2-5和ISL1，能够促使心肌细胞形成小梁；3）hPSC具备在体外分化为多种细胞的能力。
科学假说：在某种特定信号下能够诱导hPSC为NKX2-5+CD31+心内膜内皮细胞。
4
研究思路
?
5
结果解读
1.摸索hPSC诱导生成NKX2-5+CD31+EC条件
既往研究已经证实多能干细胞hPSC能够诱导生成心内膜样细胞，但是诱导生成的心内膜细胞或多或少都存在不足，其中最显著缺点是不能表达心内膜关键标记基因——NKX2-5。鉴于此作者直接使用了一种过表达NKX2-5的hPSC，即：HES3-NKX2-5eGFP/w（小编想说：简单粗暴，直接有效！），这也是本研究下游实验主要的研究平台。既往研究表明：1）FGF和BMP信号均参与NKX2-5+心脏祖细胞的分化；2）BMP4和BMP10均表达于与心内膜细胞相邻发育的早期心肌细胞中；3）BMP能够诱导生心中胚层生成心室心肌细胞。于是作者将诱导条件集中在以下三种细胞因子：bFGF，BMP4以及BMP10。作者发现：在不使用bFGF，单独使用BMP4/10下，没有NKX2-5+CD31+EC诱导生成；说明bFGF是EC发育必须！单独使用bFGF则只有少量诱导NKX2-5+CD31+EC生成，而“BMP4/10+bFGF”组合下则发现大量NKX2-5+CD31+EC生成，且在第5-9天加入最佳；随后进一步摸索各种浓度组合，结果得出最佳诱导条件：BMP10（10ng/ml）+bFGF（50ng/ml）（后续实验还证实了BMP10比BMP4更能维持NKX2-5+CD31+EC表型）。此外，还讨论了VEGF/KDR信号通路对NKX2-5+CD31+EC诱导生成的影响，结果发现：1）外源性短暂激活VEGF/KDR信号并没有促进NKX2-5+CD31+EC的诱导生成；2）持续的VEGF/KDR信号激活显著减少了NKX2-5+CD31+EC生成，却诱导出大量常规内皮细胞，即：NKX2-5-CD31+EC；作者将这类EC作为对照组细胞用于下游实验。2.鉴定NKX2-5+CD31+EC（作者分了两个维度来验证hPSC诱导生成的心内膜细胞）
2.1验证心内膜基因属性：流式细胞（FACS）分选出诱导的NKX2-5+CD31+EC（诱导心内膜细胞）、NKX2-5-CD31+EC（激活VEGF/KDR诱导的常规内皮细胞）以及NKX2-5+CD31-（心脏祖细胞）细胞群（小编提问：作者一直选用的EC对照是由VEGF/KDR激活下诱导而来，而我们可以看到在BMP10诱导条件下也能诱导出一部分NKX2-5-CD31+EC（如下图：PE+GFP-），那么，作者在实验中为什么不选择此同一BMP10刺激条件下诱导来的NKX2-5-CD31+EC作为对照？）；比较了一些心内膜祖细胞基因（NKX2-5，ISL1等）以及心内膜细胞标记基因（GATA4、GATA5、NFATC1和NRP3等）的表达情况。结果显示心内膜相关标记基因在NKX2-5+CD31+EC显著高表达，此外BMP10能够诱导NKX2-5+CD31+EC表达更高水平的NRG1（NRG1被认为是心脏小梁形成关键调节因子）。2.2验证心内膜细胞功能属性
1）NKX2-5+CD31+EC在hPSC源性心肌细胞中诱导小梁心肌标记物表达
共培养hPSC来源的SIRPA+心肌细胞和NKX2-5+CD31+EC或者hPSC来源的SIRPA+心肌细胞和NKX2-5-CD31+EC；结果发现，在NKX2-5+CD31+共培养组中的心肌细胞显著高表达小梁心肌标记基因（BMP10、NPPA、NPPB以及IRX3），这与单独使用NRG1诱导心肌细胞组非常相似。随后使用ERBB2抑制剂lap阻断NRG1/ERBB2表现出与上述相似的现象，这些结果表明来自NKX2-5+CD31+EC的NRG1/ERBB2是介导着诱导小梁生成的关键信号。此外，干扰BMP10以及NRG1显著减少了NKX2-5+CD31+EC，提示BMP10和NRG1是维持NKX2-5+CD31+表型必须的。2）NKX2-5+CD31+EC能够通过EndoMT生成瓣膜间质细胞
为了探索hPSC诱导来源的心内膜样细胞（NKX2-5+CD31+EC）是否能够通过EndoMT生成瓣膜间质细胞（VIC）样细胞，将分选的NKX2-5+CD31+EC和对照细胞NKX2-5-CD31+EC在相关诱导因子BMP2、bFGF以及TGFβ2诱导下发生EndoMT，并检测常规间质细胞标记基因和瓣膜间质细胞标记基因的表达。结果显示，hPSC来源的NKX2-5+CD31+EC能够被诱导发生EndoMT并生成瓣膜间质细胞。3.hPSC诱导的心内膜样细胞与原代胎儿心内膜细胞比较
最后作者通过单细胞测序技术比较了诱导生成的心内膜样细胞NKX2-5+CD31+EC和原代的胎儿心内膜细胞之间的差异。通过分析来自诱导心内膜样细胞中检测到的基因与胎儿心内膜细胞基因的相似性，得出两者之间具有高度的相关性(R2=0.76)，皮尔森相关性分析对个差异表达标记基因分析表明，早期(簇2)和成熟(簇3)hPSC源性心内膜细胞的转录谱与胎儿心内膜细胞的转录谱具有类似的高水平相关性。此外还鉴定出2个BMP10信号下游基因在诱导的心内膜NKX2-5+CD31+EC和原代胎儿心内膜细胞中都显著高表达，这也进一步呼应了作者前面的实验结果。6
结论
本研究描述了一种从hPSCs衍生心内膜细胞的方法，并发现BMP10是心内膜发育的关键调控因子。获得hPSC-衍生的心内膜细胞和hPSC衍生的冠状内皮细胞将使设计心脏工程结构成为可能，为人类心脏发育和疾病的体外建模提供改进的策略，并建立更具预测性的药物筛选和毒理学评估平台。此外，这些细胞为生物瓣膜的开发提供了瓣膜内皮细胞和瓣膜间质细胞的来源，有被用于临床治疗瓣膜疾病患者的潜力。点评本研究发现属于方法学上的改进，提出直接利用NKX2-5表达的hPSC诱导生成心内膜样细胞要优于先前的研究方法，同时鉴定出BMP10信号是该诱导发育的关键因子。该项工作为多能干细胞分化研究提供了一个很好的模板和思路。思维发散1.是否可以在hPSC层面进行基因编辑（瞬时或永久），从而构建更有利于诱导细胞方向的条件？2.BMP10如何诱导hPSC发育为心内膜样细胞，其背后机制？注：未经许可请勿转载！英文原文↓↓↓：
（